МУК 4.2.1018-01
Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды (взамен МУК 4.2.671-97)
МУК 4.2.1018-01. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды (взамен МУК 4.2.671-97)
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕФАКТОРЫ
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ
Методические указания
МУК 4.2.1018-01
Дата введения - 1 июля 2001 г.
ББК 51.21
С18
1. Разработаны НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (Недачин А.Е, Доскина Т.В., Дмитриева Р.А., Тишкова Н.Ю.,Сидоренко С.Г.), Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. ЭрисманаМинздрава России (Трухина Г.М., Мойсеенко Н.Н., Сарафанюк Е.В.), Аналитическимцентрам контроля качества воды “Роса” (Кашкарова Г.П.), Федеральным центромгассанэпиднадэора Минздрава России (Кривопалова Н.С., Сорокина Р.С.), Центромгоссанэпиднадзора в г. Москве (Салова Н.Я., Малышева З.Г., Кожевникова Н.А.),Центром госсанэпиднадзора в Московской области (Козлова А.Т.), Московским НИИгенетики (Бовыкина Н.М.), НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды(Русанова Н. А.), Российской медицинской академией последипломного образования(Власова И. В.), Российским государственным медицинским университетом(Пивоваров Ю.П.).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом РоссийскойФедерации - Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 9февраля 2001 г.
3. С момента ввода данных методических указаний считаются утратившимисилу методические указания MУK 4.2.671-97 “Методысанитарно-микробиологического анализа питьевой воды” иИнформационно-методическое письмо Департамента государственногосанитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения РоссийскойФедерации № 1100/1670-98-111 “О дополнительных мерах по осуществлению контролякачества питьевой воды по микробиологическим и паразитологическим показателям”.
4. Введенывпервые.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методысанитарно-микробиологического контроля качества питьевой воды в отношении ееэпидемической безопасности по показателям СанПиН 2.1.4.559—96 “Питьевая вода.Гигиенические требования к качеству води централизованных систем питьевоговодоснабжения. Контроль качества”.
1.2. Методические указания предназначены для лабораторий организаций,предприятий и иных хозяйственных субъектов, осуществляющих производственныйконтроль, а также органов санитарно-эпидемиологической службы” обеспечивающихгосударственный и ведомственный санитарно-эпидемиологической надзор закачеством питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения.
2. Нормативные ссылки
2.1. Санитарные правила и нормы. “Питьевая вода. Гигиеническиетребования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения.Контроль качества”. СанПиН 2.1.4.559—96.
2.2. Санитарные правила “Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности игельминтами”. СП 1.2.731—99.
2.3. ГОСТ 18963—73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологическогоанализа.
3. Отбор, хранение н транспортирование проб
3.1. Общие требования к отбору проб
3.1.1. Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа потехнике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.
3.1.2. Для отбора проб воды используют специально предназначенную дляэтих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения,изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.
3.1.3. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками(силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (изалюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т. ч. пробки,должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.
3.1.4. При отборе проб в одной и той же точке для различных целейпервыми отбирают пробы для бактериологических исследований. Если отбирают водупосле обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточногоколичества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят достерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 10 мг на500 мл воды.
3.1.5. Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открываютнепосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Вовремя отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскиватьпосуду запрещается.
3.1.6. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб изкрана производят после предварительной его стерилизации обжиганием ипоследующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. Приотборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно изкрана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок, Есличерез пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор пробпроизводят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующейконструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).
При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой иповерхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.
После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.
3.1.7. Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора пробводы с указанием места, даты, времени забора, фамилии Специалиста, отбиравшегопробу, и другой информации.
3.2. Хранение н транспортирование проб
3.2.1. Доставку проб питьевой воды осуществляют вконтейнерах-холодильниках при температуре, (4-10)°С. В холодный период годаконтейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающимипредохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок началаисследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.
Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 чпосле забора.
Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температурахранения, анализ пробы проводить не следует.
Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированныхконтейнерах.
4. Оборудование, расходные материалы, реактивы,питательные, среды
4.1. Оборудование
Термостат для температурного режима (37 ± 1) °С
Термостат для температурного режима (44 ± 1) °С
Термостат или водяная баня для температурного режима (44 ± 0,5) °С
Водяная баня длятемпературного режима (75 ± 5) °С
Водяная баня илитермостат для температурного режима (45 - 49) °С (для питательных сред)
Прибор длямембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или47 мм и устройство для создания разрежения (0,5-1,0) атм
Весылабораторные общего назначения
4 кл. точности,с пределом взвешивания до 1000 г ГОСТ24104—80
Максимальныйтермометр ртутный с диапазоном измерения от 20 до 200 °С с ценой деления шкалы1 °С
Термометрртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С с ценой деления шкалы 0,5 °С
рН-метр,обеспечивающий измерение с погрешностью до 0,01
Дистиллятор,обеспечивающий качество
дистиллированнойводы не ниже ГОСТ6709—72
Стерилизаторсуховоздушный для температурного режима (180 ± 5) °С
Стерилизаторпаровой
Холодильникбытовой электрический
Вытяжной шкафдля работы с хлороформом при проведении анализа на колифаги
Нагревательныйприбор для варки питательных сред либо магнитные мешалки с подогревом до 300 °С
Прибор для счетаколоний бактерий
Лупа сдвукратным увеличением
Дозаторы дляразлива питательных сред
Дозаторыпипеточные
Облучательбактерицидный
Оптическийстандарт мутности на 10 ед.
Горелки газовыеили спиртовки
Петлибактериологические
Поплавкибактериологические
Пинцеты дляработы с мембранными фильтрами
Штативы дляпробирок
Емкостиэмалированные
4.2. Расходные материалы
Мембранныефильтры для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм иразмером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичнойспособностью фильтрации, имеющие сертификат качества
Индикаторыбумажные для определения рН в диапазоне 6—8 с интервалом определения 0,2—0,3
Фольгаалюминиевая, колпачки силиконовые, металлические
Пипетки,вместимостью 1, 5, 10 мл с ценой деления 0,1 мл (многоразового, илиодноразового использования) ГОСТ 29227—91
Пробирки (многоразовогоили одноразового использования) ГОСТ 25336—82
Цилиндры,вместимостью 100, 250, 500 мл,
или мензурки,вместимостью 250, 500, 1000 мл ГОСТ1770—74
Чашкибактериологические (Петри) ГОСТ23932—90
Воронкистеклянные ГОСТ25336—82
Пробки(силиконовые, резиновые и другие, выдерживающие стерилизацию сухим жаром илиавтоклавированием)
Бумагафильтровальная лабораторная ГОСТ12026—76
Вата хлопковаямедицинская гигроскопическая ГОСТ5556—81
Марлямедицинская ГОСТ9412—77
Карандаши илифломастеры по стеклу
Лейкопластырь
Перчаткирезиновые
4.3. Химические реактивы
Все химическиереактивы должны соответствовать квалификации не ниже ч. д. а.
Железосернокислое закисное (7-водное) ГОСТ4148—78
Бромтимоловыйсиний ТУ6—09—20—86—77
Кислота соляная ГОСТ3118—77
Натрийсерноватисто-кислый (тиосульфат натрия) 5-водный ГОСТ27068—86
Натрий хлористый ГОСТ4233—77
Натрий гидратокиси ГОСТ4328—77
Калий гидратокиси ГОСТ24363—80
Спирт этиловыйректификованный медицинский ГОСТ5962—67
Спирт этиловыйтехнический ГОСТ18300—87
Глюкоза ГОСТ6038—79
Лактоза ГОСТ6038—74
Натрийсернисто-кислый (сульфит натрия) ГОСТ903—76
a-нафтол* ГОСТ5838—79
Розоловаякислота
Фенилендиаминовыесоединения*
(тетраметил-п-фенилендиамингидрохлорид,
диметил-п-фенилендиаминсоляно-кислый)
Фуксин основной* ТУ6—09—4119—75
Хлороформтехнический* ГОСТ20015—76
Стрептомицинстерильный
Йод кристаллический ГОСТ4159—64
Калий йодистый ГОСТ4232—65
Генциан фиолетовый кристаллический
Фенол ГОСТ6417—72
Примечание.
* Вещества обладают канцерогенным имутагенным действием, работа с ними требует соблюдения мер предосторожности.
4.4. Питательные среды
Агар Эндо сухой
Агармикробиологический ГОСТ17206—84
Агар питательныйсухой ТУ42—14—33—75
Сухой препарат синдикатором ВР и лактозой или среда Гисса с лактозой
Сухойпитательный бульон
Пептон сухойферментативный для бактериологических целей ГОСТ13805—76
Системыиндикаторные бумажные (СИБ)
- СИБ-лактоза
- СИБ-оксидаза
Допускаются к использованию коммерческие питательные среды, диагностическиепрепараты и системы идентификации производства зарубежных фирм, предназначенныедля целей описываемых методов. Питательные среды и биологические препаратызарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ISO 9000 или EN 29 000.
При использовании следует руководствоваться рекомендациямифирмы-производителя.
Все обезвоженные коммерческие питательные среды и препаратыотечественного производства должны иметь сертификат соответствия.
4.5. Тест-культуры микроорганизмов
4.5.1. Контрольный колифаг MS2, штамм ВКПМ-3254Е. coli K12 F+ StrR получают вГНИИ Генетика - Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ -Россия, 113545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, Д. 1).
4.5.2. Штамм Е. coli Ml7—02 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonasfluorescens получают в Государственном Национальном Органе контролямедицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасовича Минздрава России(Россия, 121002, г. Москва, ул. Сивцев-Вражек, д. 41).
Примечание.
В производственных лабораториях,расположенных на территории водопроводных станций, следует использовать штамм Pseudomonas fluorescens.
5. Приготовление питательных сред и реактивов
5.1. Общие положения
Предпочтительно использование стандартизованных сухих питательных средпромышленного производства.
При использовании промышленных сухих питательных сред их приготавливаютв соответствии с указаниями изготовителя на этикетке.
В этом случае следует соблюдать способ применения и срок храненияпитательных сред, указанные на упаковках.
Сухие питательные среды хранят в сухих помещениях, в темноте, прикомнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды сизмененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим срокомгодности не используют.
Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют водудистиллированную по ГОСТу 6709-72.
Питательныесреды готовят в посуде из инертного материала.
Учитывая возможное изменение рН питательных сред после кипячения истерилизации, окончательный контроль рН проводят в готовой среде притемпературе 25 °С с использованием индикаторной бумаги.
После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения прикомнатной температуре. При необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждаютдо температуры (50—60) °С.
Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна бытьдоведена до комнатной.
5.2. Питательный бульон
5.2.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства поспособу, указанному на этикетке.
5.2.2. Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовятпутем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.
5.3. Питательный агар
5.3.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства поспособу, указанному на этикетке.
5.3.2. Питательный агар для определения колифагов прямым методомготовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от прописи.
5.3.3. Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленномсостоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлениюне подлежит.
5.3.4. Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухойпитательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить принагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0—7,2, разлить впробирки и стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.
5.3.5. Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного постандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовятраствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар,отмеренный по объему и остуженный до температуры (45—49) °С, вносятприготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 млпитательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара.Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.
5.4. Фуксин-сульфитная среда Эндо
5.4.1.Основная модификация
Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Если наповерхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимоподсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2—3 суток в темноте, еслипроизводителем не оговорены другие сроки.
5.4.2.Повышение дифференцирующих свойств среды
Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до(60—70) °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения растворафуксина - не более 1 мес.
5.4.3. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты
В случаях, когда мембранные фильтры зарастают микрофлорой, неотносящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавлениена 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты.Срок хранения раствора розоловой кислоты -не более 1 мес.
Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют толькопри работе методом мембранной фильтрации.
5.5. Лактозо-пептонная среда
10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют принагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентовустанавливают рН 7,4—7,6, разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при (112±2) °С 12 мин.
Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды всеингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки ипо 10 мл во флаконы.
5.6. Питательные среды для подтверждения способностиферментировать лактозу до кислоты и газа
5.6.1. Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата
Готовят по способу,указанному на этикетке.
Срок хранения -не более 2 недель при комнатной температуре.
Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цветпитательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. Пригазообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толщесреды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ можетулетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толщесреды “карманы” -потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.
5.6.2.Полужидкая среда с лактозой
Готовят приотсутствии сухого препарата.
В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрияхлористого, (4-5) г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2—7,4,добавляют 1 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуютпри (120±2)°С 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают докипения, разливают в стерильные пробирки на; высоту (3—5) см и стерилизуют при(112±2) °С 12 мин. Срок хранения - неболее 2 недель при комнатной температуре.
Правильно приготовленная среда зеленого цвета с синеватым оттенком(цвет, бутылочного стекла). При образовании кислоты цвет среды изменяется нажелтый.
5.6.3.Лактозо-пептонная среда
Готовят по п. 5.5 с добавлением 1 мл 1,6%-ного спиртового растворабромтимолового синего на 1 л и разливают по (3—5) мл в пробирки с поплавком.
5.6.4.СИБ-лактоза
Готовят попрописи завода-изготовителя.
5.7. Реактивы для оксидазного теста
5.7.1.Вариант 1
1 %-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовятперед употреблением.
5.7.2.Вариант 2
Реактив № 1.1 %-ный спиртовой раствор a-нафтола.
Реактив № 2. 1 %-ный водный раствор фенилендиаминовогосоединения.
Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1 - доодного месяца, 2 - до одной недели. Перед употреблением к трем частям первогораствора добавляют семь частей второго раствора.
Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановкиоксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги).
Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазуследует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens) и отрицательную оксидазнуюреакцию (Е. соli).
5.8. Железо-сульфитный агар
В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара (по п. 5.4)добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы,автоклавируют при (112 ± 2) °С 12 мин (основная среда).
20 %-ный раствор сульфита натрия (Na2SO3)и 8 %-ный раствор железа серно-кислого закисного (FеSO4) или железа хлористого (FeCl2)готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде настерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полногорастворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной средывносят 5 мл 20 %-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл8 %-ного раствора сернокислого железа, перемешивают и стерильно разливают впробирки высоким столбиком (12—15) см для работы методом мембранной фильтрацииили во флаконы для работы методом прямого посева.
5.9. Реактивы для окраски препаратов по Граму
5.9.1. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующимобразом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 гфенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
5.9.2. Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 гйодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Хранить во флаконеиз темного стекла.
5.9.3. Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основногофуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г фенола растирают вступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
6. Подготовка к анализу
6.1. Подготовка посуды и материалов
Лабораторную посуду моют, ополаскивают сначала водопроводной, затемдистиллированной водой и высушивают.
Пробирки, колбы, бутылки, флаконы закрывают силиконовыми иливатно-марлевыми пробками и колпачками (силиконовые, металлические, из фольгиили плотной бумаги).
Пипетки со вставленными тампонами из ваты укладывают в металлическиепеналы или заворачивают в бумагу.
Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу.Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушатьсяпри стерилизации.
Подготовленную посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160°С в течение 2 ч или 180 °С 1 ч, считая с момента достижения указаннойтемпературы. Стерильную посуду вынимают из стерилизационного шкафа после егоохлаждения ниже 60 °С. Срок хранения стерильной посуды - не более 10 дней.
Материалы и лабораторную посуду, разрушающиеся при температуре (160-180)°С (резина и т. п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе притемпературе (121 ± 2) °С 20 мин.
Новые резиновые пробки кипятят в 2 %-ном растворе натрия двууглекислого30 мин и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяютдважды). Затем пробки кипятят в дистиллированной воде 30 мин, высушивают,заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе.Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 мин вводопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводнойводе, высушивают, монтируют и стерилизуют.
После выполнения анализа все использованные чашки, пробирки и пипеткиобеззараживают в автоклаве при (126 ± 2) °С в течение 60 мин, в исключительныхслучаях допускается обеззараживание кипячением в 2 %-ном растворе пищевой содыили 0,5 %-ном моющего средства в течение 60 мин с момента закипания (в закрытойемкости с полным погружением в раствор).
6.2. Подготовка проб воды
Перед посевом пробу тщательно перемешивают и фламбируют горящим тампономкрай емкости. Используемые пробирки и чашки маркируют.
Перед каждым отбором новой порции воды для анализа пробу перемешиваютстерильной пипеткой.
7. Методика работы при использовании мембранных фильтров
7.1. Подготовка мембранных фильтров
Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии суказаниями изготовителя.
7.2. Подготовка фильтровального аппарата
Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным)тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения настолик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильныймембранный фильтр, прижимают его воронкой.
7.3. Фильтрование воды
В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затемсоздают вакуум.
При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через одинфильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемыводы, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы приборобеззараживают.
Следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб,которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.
При фильтровании 1 мл исследуемой воды следует в воронку налитьпредварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем внести анализируемуюводу.
После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум,воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом ипереносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри,избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра сосевшими на ней бактериями должна бытъ обращена вверх.
Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объемапрофильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можнопоместить 3—4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.
8. Проведение анализа
8.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующихколонии на питательном агаре
8.1.1.Определение понятия показателя
Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных ифакультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колониина питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые сувеличением в 2 раза.
8.1.2.Выполнение анализа
Из каждой пробыделают посев не менее двух объемов по 1 мл.
После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильныечашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашкувливают (8—12) мл (на чашку диаметром 90—100 мм) расплавленного и остуженногодо (45—49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой онсодержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя повсему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края икрышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашкиоставляют до застывания агара.
Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную банюили термостат, поддерживающие температуру (45—49) °С.
После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дноми инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24 ±2) ч.
8.1.3. У четрезультатов
Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300изолированных колоний.
Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результатвыражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.
Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают наосновании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рострасплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, иливыросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашкис последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколеотмечают “число КОЕ/ мл - ориентировочно”.
Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают“сплошной рост”.
8.2. Определение общих и термотолерантных колиформныхбактерий методом мембранной фильтрация (основной метод)
8.2.1.Определение понятия показателя
Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные,оксида-зоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти надифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегидаи газа при температуре (37 ± 1) °С в течение (24—48) ч.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общихколиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способныферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44 ± 0,5)°С в течение 24 ч.
8.2.2.Принцип метода
Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранныефильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой ипоследующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.
8.2.3.Выполнение анализа
8.2.3.1.Порядок исследования
При исследованиипитьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.
При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация300 мл воды через один фильтр.
При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличениеколичества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре(например, 10, 40, 100, 150 мл воды).
Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдениемтребований, изложенных в п. 7.
Фильтры помещают на среду Эндо, приготовленную по п. 5.4. Чашки сфильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.
Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые,плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБи ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.
Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичныхлакто-зоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блескомили без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной сторонефильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают кподтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Дляподтверждения наличия ОКБ исследуют:
- все колонии,если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
- не менее 3—4колоний каждого типа.
Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но неболее 10.
Каждую выбраннуюизолированную колонию исследуют на:
- наличиеоксидазной активности;
- принадлежность к Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата илипостановка теста Грегерсена);
- ферментациюлактозы до кислоты и газа.
8.2.3.2.Постановка оксидазного теста
Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают2—3 каплями реактива для оксидазного теста по п. 5.7. Готовые бумажные системысмачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стекляннойпапочкой или платиновой петлей (металлическая петля из нихрома может датьложноположительную реакцию) наносят штрихом на подготовленную фильтровальнуюбумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое(п. 5.7.1 вариант 1) или синее (п. 5.7.2 вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашиваниештриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется.При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.
Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получаютнедостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо напитательный агар. После инкубации тест повторяют.
8.2.3.3.Определение принадлежности к Граму
Из оксидазоотрицательной колонии делается мазок, окрашивается по Граму имикроскопируется.
На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей 1 каплюдистиллированной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемойколонии и распределяют по поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатнойтемпературе и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. Напрепарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовыйраствор генциана фиолетового на (0,5—1) мин, снимают бумагу, наливают растворЛюголя на (0,5—1) мин, сливают раствор Люголя и стекло промывают в этиловомспирте в течение (0,5—1) мин, пока не перестанет отходить краситель. Затемстекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение (1—2) мин фуксиномЦиля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывания и просушиванияпрепарата мазок микроскопируют.
Приготовлениереактивов для окраски по Граму изложено в п. 5.9.
Грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску,грамположительные окрашиваются в синий цвет. Колиформные бактерии являютсяграмотрицательными палочками.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующимиспользования оптики.
Тест Грегерсена: в капле 3 %-ного водного раствора КОН на предметномстекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После несколькихсекунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистыенити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии кграмотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити необразуются - реакция отрицательная.
8.2.3.4.Определение ферментации лактозы
Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированнойколонии засевают параллельно в две пробирки с лактоз-ной средой (п. 5.6):
- для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37 ±1) °С в течение 48 ч;
- для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду,предварительно прогретую до температуры (43—44) °С, и инкубируют притемпературе (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч.
Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидкихсредах и СИБ (п. 5.6) возможен через (4-6) ч. При обнаружении кислоты и газадают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии толькокислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч.Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч иполучения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.
Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, еепересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение (18-24) чвыполняют все необходимые подтверждающие тесты.
8.2.3.5. Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний илисплошном росте
Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложениеколоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещениямембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чемфильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченныйдистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чемчерез 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкогопроявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневогоили синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тестсчитают положительным.
Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются ивыдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.
При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до полученияизолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по п. п.8.2.3.3—8.2.3.4 (анализ качественный).
8.2.4. Учетрезультатов
8.2.4.1. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательномоксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованиемкислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательномоксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованиемкислоты и газа.
8.2.4.2. При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий навсех фильтрах результат записывают “не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл” и “необнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл”.
8.2.4.3. В случае идентификации всех выросших подозрительных колонийчисло колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах ивыражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.
Вычислениепроводят по формуле:
,
Х - числоколоний в 100 мл;
V - профильтрованный объем воды через фильтры,на которых велся учет;
а - числоподсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.
Примеры:
1. При посеве 3 фильтров по 100 мл выросло две колонии в 100 мл, наостальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформныхбактерий будет:
КОЕОКБ (ТКБ) в 100 мл
2. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл на фильтрах с профильтрованнымобъемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100—3ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и 150 мл заросли и учетуне подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, гдеполучены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 мл.
КОЕ в 100 мл
8.2.4.4. Если при выборочной проверке колоний одного типа полученынеодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ или ТКБ среди колоний этоготипа по формуле:
, где
Х - числоподтвержденных бактерий одного типа;
а - общеечисло колоний этого типа;
b - число проверенных из них;
с - числоколоний с положительным результатом.
Полученные результаты учета по каждому типу колоний суммируют и далееподсчитывают по п. 8.2.4.3—8.2.4.4.
8.2.4.5. Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, изних количество КОЕ ТКБ в 100 мл.
Ориентировочный результат может быть выдан при обнаружении типичныхколиформных колоний на среде Эндо, образованных грамотрицательнымиоксидазоотрицательными бактериями. Окончательный ответ подтверждается порезультатам ферментации лактозы.
8.2.4.6. При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах (п.8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдаетсякачественный результат “обнаружено ОКБ в 100 мл”.
Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердиласьих принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают “зароетфильтров”.
В обоих случаяханализ повторяют.
8.3. Определение общих и термотолетарных колиформныхбактерий титрационным методом
8.3.1.Определение понятия показателя
Определениепонятия показателей ОКБ и ТКБ по п. 8.2.1.
8.3.2.Область применения
Титрационныйметод может быть использован:
- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполненияанализа методом мембранной фильтрации;
- при анализеводы с большим содержанием взвешенных веществ;
- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующейполучению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.
8.3.3.Принцип метода
Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объемаводы в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальнуюплотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным ибиохимическим тестам.
8.3.4.Выполнение анализа
При исследовании питьевой воды качественным методом (текущийсанэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл.
При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ иТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по10 мл, 3 объемов по 1 мл.
Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду,приготовленную по п.5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 млконцентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 млсреды обычной концентрации.
Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час.инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмеченоналичие роста (помутнение) и образование газа, производят высевбактериологической петлей на сектора среды Эндо (п. 5.4.1) для полученияизолированных колоний.
Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате иокончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считаютотрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, гдеотмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев насектора среды Эндо.
Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение(18—20) ч.
При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на средеЭндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных иликрасных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром иотпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общихколиформных бактерий в данном объеме пробы.
Наличие ОКБ требуется подтвердить:
- если в среде накопления отмечено только помутнение;
- если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнениеу исследователя. В этих случаях:
- проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлейподозрительной колонии;
- выполняют оксидазный тест по п. 8.2.3.2;
- подтверждают принадлежность к Граму по п. 8.2.3.3;
- подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных1—2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п. 5.6 споследующей инкубацией посевов при температуре (37 ± 1) °С в течение (24—48) ч.
При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндообщепринятыми бактериологическими методами.
Отрицательный ответ дают, если:
- в среденакопления нет признаков роста;
- на секторахсреды Эндо нет роста;
- на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерийколонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т. п.);
- все колонииоказались оксидазоположительными;
- все колонииоказались грамположителъными;
- если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмеченогазообразования.
Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают ссекторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делаютпосев 2—3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любойиз лактозных сред, приготовленных по п. 5.6.
Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С.Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют притемпературе (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через(4—6) ч.
При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндолактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерийферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °Сдают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всехостальных случаях дают отрицательный ответ.
Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производитьвысев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение игазообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п. 5.6 ипрогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостатепри температуре (44±0,5)°С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа даютположительный ответ.
8.3.5. Учетрезультатов
При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественнои при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись впротоколе “обнаружены в 100 мл”.
При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятноечисло (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл. 1.1 приложения 1.
Результатсообщают без доверительного интервала.
При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованныхобъемах выдают заключение в протоколе “не обнаружены в 100 мл”.
8.4. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий
8.4.1.Определение понятия показателя
Сульфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробныепалочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитномагаре при температуре (44 ± 1) °С в течение (16—18) ч.
8.4.2.Принцип метода
Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре вусловиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.
8.4.3.Выполнение анализа
8.4.3.1. Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках притемпературе (75 ±5)°С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм.
При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно непроизводить.
Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 мл. Принеобходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (на фильтрах)выросло не более 10—15 колоний. При этом ориентируются на результаты предыдущихисследований.
Фильтрование воды производят в соответствии с требованиями, изложеннымив п. 7.
8.4.3.2.Определение методом фильтрования в пробирках
Перед посевом пробирки с железо-сульфитным агаром, приготовленным по5.8, расплавляют на водяной бане (не кипятить!). В течение посева поддерживаютсреду нагретой до (70—80) °С в водяной бане.
После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтрфламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в видетрубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшимибактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается постенке пробирки.
Сразу же после посева пробирку с агаром, и фильтром для созданияанаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой.Культивируют посевы при (44 ± I) °С в течение (16—18)ч.
8.4.3.3. Определение методом фильтрования в чашках Петри
Чашки Петри диаметром (55—60) мм заливают тонким слоемжелезо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр поместить фильтрующейповерхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром небыло пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаромдо верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для созданияанаэробных условий. Культивируют посевы при (44 ± 1) °С в течение (16 — 1 8) ч.
8.4.3.4.Определение прямым посевом
Железо-сульфитный агар во флаконах и пробу воды готовят, как это описанов п. 8.4.3.1.
В стерильныепробирки вносят:
- по 10 мл в 2пробирки (объемом не менее 30 мл) или
- по 5 мл в 4пробирки (объемом по 15 мл).
Посевы заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве,превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливать по стенке пробирки, избегаяобразования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещаяее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевыинкубируют при (44 ± 1) °С в течение (16-18) ч.
8.4.4. Учетрезультатов
Количественному учету подлежат только те посевы, где полученыизолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах,так и в толще питательной среды.
Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующихклостридий в 20 мл воды.
При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ “необнаружено в 20 мл воды”.
При невозможности учета колоний из-за сливного роста результатоценивается как качественный, в протоколе отмечают “обнаружено в 20 мл”. Принеобходимости получения количественного результата анализ повторяют.
8.5. Определение колифагов
8.5.1.Определение понятия показателя
Колифаги - бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре (37 ± 1)°С через (18 ±2) чзоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.
8.5.2.Титрационный метод определения колифагов
8.5.2.1.Принцип метода
Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительномнакоплении колифагов в среде обогащения на культуре Е. coli ипоследующем выявлении зон лизиса (просветления) газона Е. coliна питательном агаре.
8.5.2.2.Область применения
Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевойводы.
8.5.2.3.Подготовка тест-культуры Е. coli K12 StrR.
На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь,приготовленную следующим образом: культуру Е. coli засеваютв пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином (п. 5.3.5). Через(18 ±2) ч инкубации при температуре (37±1)°С произвести смыв бактерий с косяка5 мл стерильного физиологического раствора (0,85 %-ный раствор NaCl) и по стандарту мутности готовят взвесь Е. coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1мл.
Допускается использование 4-часовой бульонной культуры Е. coli, полученной путем подращивания в термостате притемпературе 37°С. Концентрация 109 бактериальных клеток Е. coli содержится в 2 мл.
8.5.2.4.Проведение качественного анализа
В исследуемую пробу воды объемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратногопитательного бульона (приготовленного по п. 5.2.2) и 1 мл подготовленного смыватест-культуры или 2 мл 4-часовой бульонной культуры (п. 8.5.2.3).
Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е. coli (или0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливаютпитательным агаром.
Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контролем Е. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 ±1) °С в течение (18 ± 2) ч.
После инкубации из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл идобавляют 1 мл хлороформа.
Пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой,энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объему пробыи оставляют при комнатной температуре не менее 15 мин до полного осажденияхлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до (45—49) °С питательныйагар добавляют приготовленный смыв бактерий Е. coli (п.8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100мл агара.
В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 млобработанной хлороформом пробы (не касаясь хлороформа) и заливают смесьюрасплавленного и остуженного до (45—49) °С питательного агара объемом.(12—15)мл, а также одну дополнительную чашку Петри для контроля культуры Е. coli и осторожно покачивают для равномерного перемешиванияпробы воды и агара. Для полного застывания чашки оставляют на столе прикомнатной температуре на 10 мин. После застывания чашки переворачивают ипомещают в термостат на (18 ±2) ч при 37 °С.
При выполнениисерии проб ставится общий контроль для всей серии.
Учет результатов
Просмотр посевовосуществляют в проходящем свете.
Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветлениянескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизисана контрольной чашке.
В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в100 мл воды (результат качественный).
При наличии зон лизиса в контроле культуры результат считаетсянедействительным.
8.5.2.5.Проведение количественного анализа
Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратногопитательного бульона (по п. 5.2.2) и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульоннойкультуры) бактерий Е. coli (п. 8.5.2.3). В каждые 10 млпробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli.
Для контроля культуры ОД мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовойбульонной культуры) Е. coli помещают в чашку Петри изаливают питательным агаром.
Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 18±2ч.
После инкубации из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во всеисследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильнымирезиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерногораспределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной температурене менее 15 мин для осаждения хлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до (45—49) °С питательныйагар добавить приготовленный смыв бактерий Е. coli (п.8.5.2.3) из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100мл агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контролякультуры Е. coli на лизогенность и по одной чашке накаждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб водыставится один контроль культуры Е. coli.
После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделитьна 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. Накаждый сектор из соответствующей пробирки нанести пастеровской пипеткой(микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капленадосадочной жидкости (без хлороформа).
После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашкупоместить в термостат при (37 ± 1) °С на (18 ± 2) ч.
Учет результатов
Просмотррезультатов осуществляется в проходящем свете.
Учет проводится по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газонаЕ. coli.
При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизисав виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихомбактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха.
Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одномсекторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.
Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ)бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 1.2). В протоколе анализа указываетсянаиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможныхколебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел - верхний предел) колифагов в 100 мл.Результат полуколичественный.
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считатьнедействительным.
8.5.3. Прямойметод определения колифагов
8.5.3.1.Принцип метода
Определение колифагов в питьевой воде заключается в исследованиинормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учетазон лизиса (бляшек) на газоне Е. coli в чашках Петри спитательным агаром.
8.5.3.2.Область определения
Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно ститрационным при исследованиях по эпидемическим показаниям.
8.5.3.3.Проведение анализа
В питательный агар двойной концентрации (п. 5.3.2), расплавленный иостуженный до (45—49) °С, добавить смыв Е. coli (п.8.5.2.3) из расчета 2,0 мл смыва (или 4 мл 4-часовой бульонной культуры) накаждые 100 мл агара, перемешать. Исследуемые 100 мл воды разлить по 20 мл вбольшие пробирки, нагреть до (35—44) °С и немедленно (не более чем через 5 минпо достижении требуемой температуры) разлить в 5 чашек Петри и сразу же внестив каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой Е. соli.
Для контроля культуры Е. coli в одну чашку Петривнести 20 мл стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до (35—44)°С, залить 20 мл приготовленного агара с Е. coli иосторожно перемешать.
Содержимое чашек осторожно перемешать и оставить при комнатнойтемпературе до застывания. Чашки с застывшим агаром поместить дном вверх втермостат и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ±2) ч.
Учет результатов
Просмотр посевовосуществляется в проходящем свете.
Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросшихна 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшко-образующих единицах (БОЕ) на100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.
Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газонатест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до5—7) мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами.
При высокихконцентрациях фага наблюдается разная картина лизиса.
Слияние негативных колоний дает “ажурный” газон Е. coli,рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошноголизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.
При прямом посеве возможен лизис, маскируемый негомогенно застывшимагаром, а также закрытый сопутствующей микрофлорой. Капли конденсата инегомогенно застывший при прямом посеве агар могут приводить к образованиюартефактов на газоне Е. coli, визуально напоминающихлизис.
Предварительный учет результатов можно проводить через (5—6) чинкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выданпредварительный ответ о присутствии колифагов в воде.
Окончательный количественный учет прямого посева проводится через (18 ±2) ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 млпробы воды.
Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по даннымпрямого посева может быть выдан качественный результат: “обнаружено в 100 млводы”.
При получении отрицательного результата при работе прямым методомокончательный ответ выдается по результатам титрадионного метода.
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследованиясчитается недействительным.
8.5.4.Постановка контролей
8.5.4.1.Отрицательный контроль
Отрицательный контроль подтверждает отсутствие контаминации фагомпитательных сред, лабораторной посуды, оборудования на этапах подготовки ипроведения анализа, а также позволяет оценить способность тест-культуры E. соli давать равномерный газон.
Отрицательным контролем служит исследование стерильной водопроводнойводы, проводимое аналогично анализируемой пробе воды. Так, при анализе водытитрационным методом 10 мл стерильной водопроводной воды вносят вдополнительную пробирку. При анализе воды прямым посевом в дополнительнуюшестую чашку Петри вносят 20 мл стерильной водопроводной воды.
Дополнительные посевы исследуются на колифаги аналогично основнымпробам.
При анализе серии проб отрицательный контроль может быть один на каждыйвид анализа: титрационный и прямой. В этом случае постановка отрицательногоконтроля поэтапно осуществляется после обработки всех проб данной серии.
В случае обнаружения бляшек колифагов в чашках с отрицательным контролемрезультаты исследования всей серии проб воды недействительны.
Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды,питательных сред, а также повторить контрольный посев на чистоту тест-штамма Е.coli K12 F+ StrR.
Кратностьпроведения отрицательного контроля - 1 раз в день.
8.5.4.2.Методика подтверждения фаговой природы лизиса
В сомнительных случаях при работе как титрационным, так и прямымметодами необходимо провести контрольный посев на подтверждение фаговой природылизиса.
С этой целью бактериологической петлей извлекают участок агара,подозрительный на колифаги, помещают его в 5 мл питательного бульона, кудадобавляют каплю тест-культуры Е. coli и инкубируют при37°С в течение (16—18) ч. Полученную культуру обрабатывают хлороформом иисследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлей или пипеткой на секторапитательного агара аналогично способу, описанному в п. 8.5.2.5. Лизис на любомиз секторов расценивается как подтверждение наличия фага.
Приложения
Приложение 1
Таблицы расчетанаиболее вероятного числа микроорганизмов
Таблица 1.1
Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 мл питьевойводы
|
Число положительных результатов из: |
НВЧ |
Доверительный интервал (95 %) |
|||
|
3 объемов по 100 мл |
3 объемов по 10 мл |
3 объемов по 1 мл |
бактерий в 100 мл |
нижний |
верхний |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
0 |
0 |
1 |
0,3 |
0 |
1,4 |
|
0 |
0 |
2 |
*1 |
|
|
|
0 |
0 |
3 |
* |
|
|
|
0 |
1 |
0 |
0,3 |
0,1 |
1,4 |
|
0 |
1 |
1 |
* |
|
|
|
0 |
1 |
2 |
* |
|
|
|
0 |
1 |
3 |
* |
|
|
|
0 |
2 |
0 |
0,6 |
0,1 |
2,8 |
|
0 |
2 |
1 |
* |
|
|
|
0 |
2 |
2 |
* |
|
|
|
0 |
2 |
3 |
* |
|
|
|
0 |
3 |
0 |
* |
|
|
|
0 |
3 |
1 |
* |
|
|
|
0 |
3 |
2 |
* |
|
|
|
0 |
3 |
3 |
* |
|
|
|
1 |
0 |
0 |
0,4 |
0,1 |
1,7 |
|
1 |
0 |
0 |
0,7 |
0,2 |
3,4 |
|
1 |
0 |
2 |
* |
|
|
|
1 |
0 |
3 |
* |
|
|
|
1 |
1 |
0 |
0,7 |
0,2 |
3,4 |
|
1 |
1 |
1 |
1,1 |
0,2 |
5,2 |
|
1 |
1 |
2 |
* |
|
|
|
1 |
1 |
3 |
* |
|
|
|
1 |
2 |
0 |
1,1 |
0,2 |
5,3 |
|
1 |
2 |
1 |
* |
|
|
|
1 |
2 |
2 |
* |
|
|
|
1 |
2 |
3 |
* |
|
|
|
1 |
3 |
0 |
* |
|
|
|
1 |
3 |
1 |
* |
|
|
|
1 |
3 |
2 |
* |
|
|
|
1 |
3 |
3 |
* |
|
|
|
2 |
0 |
0 |
0,9 |
0,2 |
4,3 |
|
2 |
0 |
1 |
1,4 |
0,3 |
6,7 |
|
2 |
0 |
2 |
* |
|
|
|
2 |
0 |
3 |
* |
|
|
|
2 |
1 |
0 |
1,5 |
0,3 |
6,9 |
|
2 |
1 |
1 |
2 |
0,4 |
9,6 |
|
2 |
1 |
2 |
* |
|
|
|
2 |
1 |
3 |
* |
|
|
|
2 |
2 |
0 |
2 |
0,5 |
9,9 |
|
2 |
2 |
1 |
3 |
0,6 |
12,9 |
|
2 |
2 |
2 |
* |
|
|
|
2 |
2 |
3 |
* |
|
|
|
2 |
3 |
0 |
3 |
0,6 |
133 |
|
2 |
3 |
1 |
* |
|
|
|
2 |
3 |
2 |
* |
|
|
|
2 |
3 |
3 |
* |
|
|
|
3 |
0 |
0 |
2 |
0,5 |
10,8 |
|
3 |
0 |
1 |
4 |
0,8 |
18,0 |
|
3 |
0 |
2 |
6 |
1,4 |
29,7 |
|
3 |
0 |
3 |
* |
|
|
|
3 |
1 |
0 |
4 |
0,9 |
20,0 |
|
3 |
1 |
1 |
8 |
1,6 |
35,0 |
|
3 |
1 |
2 |
12 |
2,5 |
53,8 |
|
3 |
1 |
3 |
* |
|
|
|
3 |
2 |
0 |
9 |
2,0 |
43,6 |
|
3 |
2 |
1 |
15 |
3,2 |
69,8 |
|
3 |
2 |
2 |
21 |
4,6 |
100,3 |
|
3 |
2 |
3 |
29 |
6,2 |
136,4 |
|
3 |
3 |
0 |
24 |
5,1 |
112,1 |
|
3 |
3 |
1 |
46 |
9,3 |
216,0 |
|
3 |
3 |
2 |
110 |
23,5 |
516,6 |
|
3 |
3 |
3 |
³ 240 |
— |
— |
____________
1 Вероятность ниже допустимогоуровня. Количественный учет невозможен, результат оценивается качественно.
Таблица 1.2.
Расчет наиболее вероятного числа (НВЧ) колифагов в 100 мл
Наиболее вероятное число (НВЧ) в 100 мл
|
Число положительных результатов |
НВЧ |
Вероятность |
Нижний |
Верхний |
|
|
из 1 объема по 50 мл |
из 5 объемов по 10 мл |
в 100 мл |
|
предел |
предел |
|
1 |
4 |
16,1 |
0,4095 |
1,9 |
113,9 |
|
1 |
3 |
9,3 |
0,3422 |
1,1 |
77,4 |
|
1 |
2 |
5,6 |
0,3218 |
0,7 |
46,4 |
|
1 |
1 |
3,2 |
0,3039 |
0,4 |
26,2 |
|
1 |
0 |
1,4 |
0,2500 |
0,2 |
11,5 |
|
0 |
5 |
6,9 |
0,0010 |
0,8 |
57,6 |
|
0 |
4 |
5,1 |
0,0060 |
0,6 |
42,5 |
|
0 |
3 |
3,6 |
0,0222 |
0,4 |
29,6 |
|
0 |
2 |
2,2 |
0,0671 |
0,3 |
18,5 |
|
0 |
1 |
1,1 |
0,1937 |
0,1 |
8,8 |
Приложение 2
(обязательное)
Ведение эталонных культур
Ведение эталонных культур обеспечивает максимальное сохранение типовыхсвойств штаммов, что достигается соблюдением принципов их культивирования,контроля и хранения.
Согласно санитарным правилам СП 1.2.036—95 “Порядок учета, хранения,передачи и транспортирования микроорганизмов III—IV групп патогенности”, п. 3.1.6 “Производственнымпредприятиям, контролирующим готовую продукцию, разрешается иметь толькоколлекцию типовых культур, предусмотренных нормативно-техническойдокументацией”.
Хранение культур осуществляется в соответствии с п. 3.2.12 СП1.2.036—95. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III— IV групп патогенности.
1. Ведение бактериальных культур аэробов и факультативныханаэробов
Основные положения
В качестве контрольных тест-штаммов используют эталонные культуры,полученные из официально признанной коллекции микроорганизмов (п. 4.5).
Хранение запасов рабочей культуры осуществляется в столбике полужидкогоагара, срок хранения 3 мес.
Для целевого использования пригодна суточная (“ночная”) культураэталонного штамма, прошедшая не более 2 пассажей на питательных средах,с момента высева со среды для хранения запасов рабочей культуры.
Восполнение запасов рабочей культуры допускается не более трех раз. Вэтой связи срок использования эталонной культуры с момента вскрытия ампулы - 1год.
На этапах восстановления из лиофилизированного состояния и восполнениязапасов рабочих культур осуществляется контроль сохранения видовых и паспортныхсвойств тест-культуры.
Культура сизмененными свойствами в анализе не используется.
По истечении года необходимо получить новую лиофилизированную эталоннуюкультуру из коллекции микроорганизмов.
Процедураведения культуры включает следующие этапы:
- восстановлениелиофилизированной культуры;
- создание ихранение запасов рабочей культуры;
- восполнениезапасов рабочей культуры;
- подготовкакультуры для целевого использования в анализе;
- контрольвидовых и паспортных свойств.
1.1.Восстановление лиофилизированной эталонной культуры
Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают надпламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются кнагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрываюттрехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошоотжатой, и обламывают пинцетом.
После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение (1—2)мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают вдезраствор. В ампулу вносят » 0,5 млпитательного бульона (п. 5.2.1) для регидратации. Содержимое ампулыперемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробиркус питательным бульоном и инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 18—24 ч.
После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенныйпитательный агар в две пробирки, (п. 5.3.1).
При восстановлении штамма Е. coli K12F+ StrR посев осуществляется на скошенныйпитательный агар, содержащий стрептомицин (п. 5.3.5).
Посевыинкубируют при 37 °С в течение (18—24) ч.
Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на соответствиеполученного штамма видовым, паспортным свойствам (п. п. 1.5.2—1.5.5 приложения2).
Второй посев на скошенном питательном агаре используют для созданиязапасов рабочей культуры (п. 1.2 приложения 2).
Оставшуюся бульонную культуру Е. coli Ml7-02используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано впункте 1.5.1 приложения 2.
При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам и (или) приналичии более 25 % полиморфных (нетипичных) колоний в R-формеполученную культуру для работы не используют.
1.2. Созданиезапасов рабочей культуры
При удовлетворительном прохождении контрольных тестов (п. п. 1.5.1—1.5.5приложения 2) культуру со скошенного питательного агара (для Е. coli K12 F+ StrR - с питательного агарасо стрептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром (п. 5.3.4). Взависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4—10 пробирок,из расчета по 1—3 пробирки на 1 мес. работы и 1 пробирки для восполнениязапасов рабочей культуры через 3 мес. на следующий квартал (п. 1.3 приложения2).
Посевы инкубируют (18—24) ч при 37 °С. При наличии роста пробиркизакрывают резиновыми (силиконовыми) пробками и закладывают на хранение притемпературе (4—8) °С.
Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочихзапасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательнохранить в отдельном холодильнике.
1.3. Восполнение запасоврабочей культуры
Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце третьего,шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3 мес.).
Для восполнения запасов рабочей культуры используется субкультура насреде хранения, полученная ранее при создании запасов или при очередном ихвосполнении.
Из пробирки с культурой, предназначенной для восполнения запасов,производят посев в питательный бульон. Посевы инкубируют при 37 °С (18—24) ч.
После инкубации из питательного бульона делают высев петлей в двепробирки со скошенным питательным агаром (п. 5.3.1). При ведении штамма Е. coli K12 F+ Str* посев осуществляется на скошенныйпитательный агар, содержащий стрептомицин (5.3.5). Посевы инкубируют при 37 °С(18 ± 2) ч.
Один из посевов используют для постановки тестов на соответствиеполученного штамма видовым, паспортным свойствам (п. п. 1.5.2— 1.5.5 приложения2).
Второй посев на скошенном питательном агаре используют для восполнениязапасов рабочей культуры (п. 1.2 приложения 2).
Оставшуюся бульонную культуру Е. coli Ml7—02используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано вп. 1.5.1 приложения 2.
При наличии более 25 % полиморфных (нетипичных) колоний и(или) принесоответствии штамма видовым и паспортным свойствам полученную культуру длядальнейшей работы не используют.
Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начатьпроцедуру ведения тестового штамма сначала.
При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура закладкикультуры на хранение осуществляется согласно п. 1.2 приложения 2.
Восполнениезапасов рабочей культуры проводят только три раза.
По истечении года использования необходимо получить новую эталоннуюкультуру из коллекции микроорганизмов.
1.4.Подготовка культуры для целевого использования в анализе
Накануне использования культуру с полужидкого агара высевают на 2пробирки со скошенным питательным агаром (п. 5.3.1). Для культуры Е. coli K12 F+ StrR используют питательныйагар со стрептомицином (п. 5.3.5). Посев инкубируют (18—24) ч при 37 °С.
Культуру из одной пробирки используют по назначению. Вторая пробирка скультурой на скошенном питательном агаре используется для получения культурыдля работы на следующий (второй) день.
При необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высевснова производят с полужидкого агара.
1.5. Контрольэталонных бактериальных культур
Постановкаконтроля включает:
- оценку степенидиссоциации культуры Е. coli Ml7—02;
- проверкувидовых свойств бактериальных культур;
- проверку способности Е. coli K12 F+StrR проверку культуры Е. coliK12 F+ StrR на однородность и отсутствиезагрязнения фагом.
1.5.1. Оценка степенидиссоциации культуры Е. coli Ml7—02
Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведенияфизиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2 чашкипитательного агара предварительно подсушенные в термостате. Шпателем посевыраспределяют по поверхности агара по полного исчезновения влаги и инкубируют втермостате при температуре (37 ± 1) °С в течение(18—24) ч.
Выбирают чашки,на которых выросло от 30 до 100 колоний.
Проверку тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуальногопросмотра изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном светечерез бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.
На питательном агаре бактерии вида Е. coli образуютколонии средней величины (3—5) мм, плоско-выпуклые, круглые, гладкие с ровнымкраем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные впрямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящемсвете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.
В R-форме колонии эшерихий более плоские,большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой, матовойповерхностью.
При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация,др.) подсчитывают количество измененных колоний и общее количествопросмотренных колоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно бытьменее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по формуле:
Если процент диссоциированных колоний более 25 %, то данная культуране пригодна для дальнейшего использования.
1.5.2.Контроль видовых свойств E. coli Ml7—02 и Е. coli K12F+ StrR
После восстановления лиофилизированной культуры проводится типированиекультуры по биохимическим свойствам до вида.
Идентификацию рекомендуется проводить с использованием тест-систембиохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенныхк применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями производителя.Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.
Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценкуэталонного штамма Е. coli проводят путем подтвержденияследующих основных свойств;
- отсутствиеоксидазной активности;
- грам-негативности;
- способности образовывать на среде Эндо характерные темно-красные(малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на среде;
- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 18 ч и 44 °С в течение 24 ч;
- способности утилизировать глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 ч.
Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригоднадля дальнейшего использования.
1.5.3.Проверка чувствительности Е. coli K12 F+ StrR
Способность Е. coli K12 F+ StrR лизироватьсяспецифичным фагом, является основополагающим свойством тест-культуры, накотором основан метод определения колифагов в воде.
Проверка чувствительности осуществляется каждый раз, когда из запасовхранения берется новая пробирка с рабочей культурой, хранящейся на полужидкомагаре.
Выполнениеанализа
Бактериальную взвесь готовят по п. 8. 5.2.3. На 100 мл расплавленного иостуженного до (45—49) °С питательного агара вносят 1 мл бактериальной взвеси иразливают в чашки. После застывания чашки на поверхность агара наносят каплю(0,05 мл) суспензии фага, не захватывая хлороформа. Инкубируют в течение 18—24ч при 37 °С. Просмотр посевов следует осуществлять в проходящем свете.
Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения анализовводы при наличии четких зон лизиса. При отсутствии зон лизиса культура непригодна для использования и подлежит замене.
1.5.4. Проверка культуры Е. coli K12 F+StrR на загрязненность фагом
Бактериальную взвесь готовят по п. 8.5.2.3, вносят в расплавленный иостуженный до температуры (45—49) °С питательный агар из расчета 1 мл взвеси на100 мл агара. Чашку Петри заливают приготовленной смесью, инкубируют притемпературе 37 °С (18—24) ч.
Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Культура должна даватьравномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует озагрязненности культуры фагами.
1.5.5. Контроль видовых свойств Pseudomonasaeruginosa и Pseudomonas fluorescens
Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:
- наличия оксидазной активности;
- грам-негативности;
- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с образованиемкольца сине-зеленого пигмента;
- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 °С;
- способности роста на питательном агаре при 42 °С в течение 24 ч (для Pseudomonas aeruginosa);
- способности роста на питательном агаре при 4 °С в течение 24 ч (для Pseudomonas fluorescens).
Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригоднадля дальнейшего использования.
2. Культивирование, хранение и контроль эталонных культурбактериофагов
В качестве эталонного штамма для проведения контроля культурыклеток-хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащийфаг MS2.
Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоитиз 2 функциональных блоков:
- восстановление лиофилизированной культуры;
- создание запасов эталонной культуры и культур для целевогоиспользования.
2.1. Восстановлениелиофилизированной культуры
Оттянутый конец ампулы с лиофилизированнымн культурами нагревают надпламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются кнагретой части, в результате чего появляются трещины.
Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.
После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение (1—2мин). Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают вдезраствор. В ампулу вносят » 0,5 млпитательного бульона для регидратации.
2.2. Создание запасов эталонных культур фага и культур для целевогоиспользования
Рабочую культуру Е. coli K12 F* StrR, хранящуюсяна полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевыинкубируют при (37 ± 1) °С (18—24) ч.
После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно засевают в3—4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при (37 ± 1)°С. Через 2 час. инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуруфага MS2, инкубацию продолжают до (18—24) ч.После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметичноукупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.
Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят встерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают,встряхивают и хранят в холодильнике.
Одну пробирку используют для целевого назначения в контролечувствительности культуры Е. coli K12 F+ StrRк фагу. Две других служат запасом эталонного фага.
Активность полученной культуры определяется титром фага. Дляиспользования допускается культура с титром более 107—108,Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получитьновую культуру или провести определение титра хранящегося фага.
2.3.Определение титра фага
Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведениикультуры фага (п. 2.2). По 1 мл каждого, разведения вносят в чашки Петри изаливают смесью питательного агара и Е. coli K12 F+StrR, приготовленной аналогично описанному в п. 1.5.4приложения 2. Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С. Пробирки с разведениямизакупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получениярезультатов при температуре (4 ± 2) °С для приготовления рабочих суспензийфага.
Через (18—24) ч инкубации просчитывают количество бляшек на чашках.Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30—100 негативных колонийфага.
При получении титра менее 107 фаг можно размножить. Для нарастаниятитра необходимо повторить описанную процедуру.
После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательнуюобработку помещения дезсредствами и обеззараживание ультрафиолетовымоблучением.
Содержание
1. Областьприменения
2. Нормативныессылки
3. Отбор,хранение и транспортирование проб
3.1. Общиетребования к отбору проб
3.2. Хранение итранспортирование проб
4. Оборудование,расходные материалы, реактивы, питательные среды
4.1.Оборудование
4.2. Расходныематериалы
4.3. Химическиереактивы
4.4. Питательныесреды
4.5.Тест-культуры микроорганизмов
5. Приготовлениепитательных сред и реактивов
5.1. Общиеположения
5.2. Питательныйбульон
5.3. Питательныйагар
5.4.Фуксин-сульфитная среда Эндо
5.5.Лактозо-пептонная среда
5.6. Питательныесреды для подтверждения способности ферментировать лактозу до кислоты и газа
5.7. Реактивыдля оксидазного теста
5.8.Железо-сульфитный агар
5.9. Реактивыдля окраски препаратов по Граму
6. Подготовка канализу
6.1. Подготовкапосуды и материалов
6.2. Подготовкапроб воды
7. Методикаработы при использовании мембранных фильтров
7.1. Подготовкамембранных фильтров
7.2. Подготовкафильтровального аппарата
7.3.Фильтрование воды
8. Проведениеанализа
8.1. Определениеобщего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре
8.2. Определениеобщих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации(основной метод)
8.3. Определениеобщих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом
8.4. Определениеспор сульфитредуцирующих клостридий
8.5. Определениеколифагов
Приложения
